Биофармацевтика > Биофармацевтика
Получение характеристик белковых агрегатов и других частиц в биофармацевтических препаратах
Частицы широко распространены в парентеральных лекарственных препаратах и остаются проблемой на протяжении всего периода их разработки и производства1–3. Эти частицы необходимо контролировать, чтобы соответствовать требованиям USP к отчетности о частицах (например, USP <788>). Кроме того, в таких биофармацевтических препаратах, как белковые терапевтические средства, эти частицы связаны с неблагоприятным воздействием на эффективность и безопасность продукта4,5. Правила FDA настоятельно рекомендуют получать подробную информацию о количестве и типах частиц, содержащихся в биотерапевтических. препаратах
Светоблокировка (Light Obscuration — LO) является основным справочным методом, используемым для мониторинга невидимых частиц (т.е. частиц диаметром 2-100 мкм) в парентеральных лекарственных препаратах. В то время как LO эффективна для подсчета и определения размера непрозрачных частиц, она менее эффективна для анализа частиц в таких биотерапевтических препаратах, как агрегаты активного фармацевтического ингредиента (АФИ), которые часто обладают высокой прозрачностью6,7. Еще одним ключевым недостатком LO и других методов анализа частиц является их неспособность записывать информацию о морфологии частиц — информацию, часто связанную с типами частиц, обнаруживаемых прибором. Информация о морфологии частиц может использоваться для получения сведений о типах частиц в образце, обнаружения новых и/или неожиданных типов частиц, присутствующих в образце, и даже для обнаружения таких распространенных артефактов в приборах для анализа частиц, как пузырьки воздуха.
Одним из способов использования информации о морфологии частиц является идентификация капель силиконового масла в образце. Силиконовое масло обычно используется в качестве смазки для шприцев, и во время использования масляный слой на стенках шприца может смещаться и образовывать дополнительные частицы в растворе8,9. Идентификация этих капель может быть полезной, так как границы раздела масло-вода, которые они создают, могут вызывать агрегацию белков9,10, а сами капли могут способствовать иммуногенности образца11,12. Методы анализа частиц, которые регистрируют информацию о морфологии частиц, могут использоваться для различения капель силиконового масла и других распространенных типов частиц (например, агрегатов АФИ, стеклянных и металлических хлопьев, фрагментов клеток, бактерий), которые могут быть в биотерапевтическом образце — информация, которая может быть содержательной при принятии решений о качестве продукции.
Микроскопия с визуализацией потока (FIM) является признанным USP ортогональным методом (согласно USP <1788>), который дополняет LO и другие стандартные методы подсчета и определения размера частиц. Приборы FIM, такие как FlowCam, захватывают изображения частиц при световой микроскопии, когда они проходят через проточную ячейку. Этот метод обнаружения частиц позволяет подсчитывать и определять размер частиц в образце жидкости. Концентрации частиц можно также оценить, используя измеренное количество частиц и объем отображаемого образца — количество, которое можно рассчитать, используя скорость потока прибора, геометрию проточной ячейки и частоту кадров камеры. Поскольку для каждой частицы записывается цифровое изображение, FIM также можно использовать для сбора информации о морфологии частиц, недоступной при измерениях LO. Ученые могут использовать либо необработанные данные изображений, либо измерения частиц, записанные программным обеспечением FlowCam VisualSpreadsheet, чтобы различать типы частиц (например, отличать частицы от активного ингредиента, а препарат от загрязняющих частиц)8,13. FlowCam LO, последнее достижение в технологиях FIM, позволяет пользователям выполнять одновременные измерения FIM и LO в одном приборе, используя одну и ту же аликвоту образца, интегрируя FIM с стандартной методикой мониторинга частиц.
В этом тематическом исследовании мы показываем, как микроскопия с визуализацией потока и FlowCam могут помочь при анализе частиц в биотерапевтических образцах. Смоделированный белковый препарат, состоящий из микрокапель силиконового масла, добавленных в белковый препарат, был приготовлен и проанализирован с помощью прибора FIM FlowCam 8100. FIM удалось эффективно захватить изображения полупрозрачных частиц в этом образце — информация, которая использовалась для определения точной концентрации частиц для этого образца. Эти изображения также были проанализированы с помощью простых инструментов анализа морфологии частиц в VisualSpreadsheet для определения количества частиц силиконового масла, входящих в этот образец.
Методы
Образец моноклонального антитела NIST (mAb) с каплями силиконового масла был подготовлен и проанализирован с помощью FlowCam. Агрегаты NIST mAb получали путем заполнения 15 мл конической пробирки 2 мл препарата NIST mAb с концентрацией 1 мг/мл в в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) и энергичного встряхивания вручную. Эмульсию силиконового масла готовили путем приготовления 5% об/об раствора силиконового масла в PBS и смешивания образцов лабораторным блендером в течение 20 секунд. 0,2 мл этого раствора добавляли в раствор NIST mAb. 1 мл этого образца анализировали с использованием прибора FlowCam 8100, оснащенного камерой с оттенками серого (grayscale), объективом 10x и проточной ячейкой с полем обзора 80 мкм.
На рис. 1 показаны выходные данные FlowCam для этого образца NIST mAb в VisualSpreadsheet, программном обеспечении, используемом для работы с прибором и выполнения анализа данных. Это окно содержит информацию о частицах в образце, включая концентрацию частиц и распределение по размерам. Как показано в этом окне, образец NIST mAb содержал приблизительно 62000 частиц/мл с сильно асимметричным распределением частиц по размерам. Хотя этот тип информации доступен с помощью LO, FlowCam также возвращает изображения каждой частицы, содержащие богатую информацию о морфологии частиц. Примеры изображений FlowCam для этого образца показаны на рис. 2. Как видно из изображений, в образце наблюдалась крайне неоднородная популяция частиц — частицы различной морфологии, начиная от темных сфер и заканчивая светлыми тонкими стержнями. Если использовать только LO, эта информация о морфологии недоступна. Кроме того, многие из более светлых, более прозрачных частиц в этом образце вообще невозможно обнаружить с помощью LO из-за их относительно плохого контраста с фоновой жидкостью образца. FlowCam LO, модель FlowCam, которая может выполнять одновременный FIM и LO анализ образцов, может использоваться для подтверждения ограниченной чувствительности LO к этим полупрозрачным частицам.
Рис. 1: Окно VisualSpreadsheet, показывающее популяцию частиц для смеси эмульсии NIST mAb-силиконовое масло. На верхней гистограмме показано распределение частиц по размерам при различных концентрациях. В нижней таблице показаны некоторые общие статистические данные о частицах для образца, такие как общее количество частиц и их концентрация.
Рис. 2: Окно VisualSpreadsheet, показывающее изображения частиц образца для эмульсионной смеси NIST mAb и силиконового масла. Значения под каждым изображением представляют собой диаметр (эквивалентный сферический диаметр) частицы в мкм.
Одна примечательная популяция частиц в этом образце состоит из темных круглых частиц с ярким внешним кольцом и часто ярким центром. Эти частицы представляют собой микрокапли силиконового масла, которые были добавлены в образец во время подготовки. Изображения FlowCam позволяют пользователю различать эти микрокапли, белковые агрегаты и другие типы частиц, присутствующие в образце, — полезная информация при попытке проанализировать содержание частиц в препаратах, содержащих несколько типов частиц. Эта информация о типе частиц недоступна для других распространенных методов анализа частиц, таких как LO, и даже для других методов анализа морфологии частиц. Например, обнаружение силиконового масла невозможно при визуализации с использованием фоновой мембраны, поскольку эти капли могут проходить через мембрану, используемую для удаления жидкости из образцов перед визуализацией.
Анализ данных
VisualSpreadsheet можно использовать для автоматического различения отдельных белковых агрегатов и популяций капель силиконового масла в конкретном образце. Во время сбора данных необработанные изображения каждой частицы используются для вычисления нескольких свойств частиц, таких как диаметр частицы, соотношение сторон и интенсивность (т. е. цвет). Различные типы частиц часто демонстрируют разные значения этих свойств частиц. VisualSpreadsheet может использовать эти различия в свойствах между типами частиц для разработки фильтров и классификаторов частиц для автоматического отбора и/или сортировки частиц из образца, содержащего несколько типов частиц.
Простой фильтр для силиконового масла был создан с использованием этого набора данных FlowCam в качестве демонстрации инструментов анализа частиц в VisualSpreadsheet. Для создания этого фильтра использовалась функция программного обеспечения “Like Selected Particles (Statistical)/Как выбранные частицы (статистические)”. Функция “Like Selected Particles (Statistical)/Как выбранные частицы (статистические)” создает фильтр частиц, используя набор выбранных пользователем изображений FlowCam в наборе данных, и применяет этот фильтр ко всему набору данных для поиска изображений похожих частиц. Для приготовления этого фильтра с использованием данной функции были использованы 50 изображений капель силиконового масла из этого образца.
На рис. 3 показаны некоторые изображения, идентифицированные фильтром как капли силиконового масла в данном образце, почти все из которых демонстрируют концентрическую кольцевую структуру, характерную для этого типа частиц. Согласно этому фильтру образец NIST mAb содержал примерно 4700 капель силиконового масла/мл. Эти инструменты, входящие в VisualSpreadsheet, позволяют пользователям быстро разрабатывать простые фильтры для определения интересующих популяций частиц в смешанном образце — даже с использованием только изображений из смешанного образца. Эти простые фильтры можно было бы дополнительно улучшить, собирая изображения отдельных типов частиц и разрабатывая фильтры на основе этих изображений.
Рис. 3: Окно VisualSpreadsheet, показывающее изображения частиц, идентифицированных с помощью статистического фильтра как силиконовое масло. Значение под каждым изображением представляет собой оценку, указывающую, насколько изображение похоже на силиконовое масло. Более низкие значения этого фильтра указывают на изображения, которые наиболее точно соответствуют свойствам исходно выбранных изображений.
Выводы
Результаты, показанные здесь, демонстрируют, как можно использовать FlowCam для анализа количества и типа частиц в типичном биотерапевтическом образце — даже в образцах, содержащих полупрозрачные частицы. Изображения частиц, возвращаемые FlowCam, можно использовать для идентификации и подсчета различных типов частиц в образце, например, микрокапель силиконового масла — информация, которая недоступна для многих других анализаторов частиц. FlowCam позволяет пользователю получить более полное представление о содержании частиц в биотерапевтических препаратах, что можно использовать для обеспечения качества и эффективности конкретного препарата.