Проточный цитометр с функцией микроскопии Flowcam c 1999 года производится компанией Fluidimaging (США) и является мощным инструментом для автоматической идентификации и классификации водных микроорганизмов и биофармацевтике. Flowcam является признанным инструментом для океанографических и пресноводных исследований. Более 300 приборов используются во всем мире лабораториями, среди которых известные Институт океанографии им. Скриппса (Scripps Institution of Oceanography), Институт Альфреда Вегнера (Alfred Wegner Institute), Лаборатория океанографических наук Бигелоу (Bigelow Laboratory for Oceanographic Sciences), Вилла-Франкская зоологическая станция (d’Océanologie de Villefrance), Академия наук Китая и т.д.
Краткое описание принципа работы прибора
Проснувшись однажды утром после беспокойного сна, Грегор Замза обнаружил,
Flowcam представляет собой комбинацию автоматического микроскопа для детального морфологического анализа (размер, форма и тд.) клеток водорослей и классической функции проточного цитометра для дальнейшей (расширенной) дискриминации типов клеток. Образец пропущен через проточную ячейку при помощи перистальтического шприцевого насоса (рис. 3). Во время прохождения образца мимо объектива камеры вспышка LED подсвечивает образец сзади. Камера, срабатывающая одновременно со вспышкой, эффективно фиксирует образец. Так как в Flowcam не используется проточная жидкость (sneath fluid), прибор может вмещать достаточно большие образцы (размером до 2000 нм) в сравнении с другими приборами.
Обработка полученных снимков происходит при помощи программного обеспечения VisualSpreadsheet© . Каждое изображение проходит измерение по 26 показателям в нескольких категориях. Этими категориями являются: «Морфологические измерения» такие как диаметр, длина, ширина, периметр, округлость.
«Серая шкала»: интенсивность, прозрачность, цветовая информация и т.д.
«Спектральные измерения»: пик, площадь, ширина спектра сигналов собранная с двух каналов флюорисценции.
Морфологические измерения аналогичны выполняемым при помощи цифровой камеры на микроскопе с той лишь разницей, что в Flowcam измерения производятся на движущемся, а не на статичном потоке. Это означает, что Flowcam, работая в автоматическом режиме, собирает и обрабатывает тысячи частиц в минуту, а полученные результаты обладают высокой статистической значимостью.
Уникальное преимущество Flowcam состоит в том, что анализ данных происходит на основе морфологических показателей и серой шкалы. В то время как обычные проточные цитометры проводят анализ лишь при помощи спектральной дискриминации. Спектральная дискриминация, тем не менее, применяется и в Flowcam благодаря наличию флюоресцентных возможностей.
Данный факт позволяет преодолеть ограничения, которыми обладают обычные проточные цитометры, использующие при анализе данных только показатель относительного размера (ESD) полученный прямым рассеянием. В дополнение к этому простому морфологическому измерению проточный цитометр может характеризовать клетки только на основе их «спектральной сигнатуры», собирая флуоресцентные сигналы в различных «полосах» узких диапазонов длин волн, для аппроксимации непрерывного электромагнитного спектра, что может быть выполнено при помощи обычного спектрометра.
Пример анализа
Для демонстрации совместной «морфологической» и «спектральной» обработки данных прибором был взят образец смешанных культур водорослей. Система была запущена в режиме “Fluorescence Trigger”, соответственно камера срабатывала только по факту события флюоресценции. В стандартном образце океанической или озерной воды данный метод позволяет быть уверенным что все интересующие нас образцы (живые водоросли) будут детектированы. Частицы же не обладающие флюорисцентными свойствами, такие как детрит или осадок, останутся незамеченными. Для нефлюоресцирующих организмов (например гетеротрофы) Flowcam совместно с “Fluorescence Trigger” использует режим “Scatter Trigger”.
На рис. 4 показан результат выполнения анализа образца. В левом окне отображаются сводные статистические данные, гистограммы и диаграммы рассеяния, а в правом окне отображаются изображения ячеек в окне коллажа, которое можно просматривать в интерактивном режиме, фильтровать и классифицировать с помощью программного обеспечения VisualSpreadsheet.
Функция распознавания паттернов используется программным обеспечением VisualSpreadsheet для автоматической классификации различных типов микроорганизмов, обнаруженных в образце. Данный процесс происходит путем создания «библиотек» изображений клеток определенных таксонов (библиотеки нужно создавать только один раз, после этого их можно многократно использовать). При использовании функции распознавания паттернов программное обеспечение выполняет «n-мерный» статистический анализ каждого изображения частицы (где «n» — количество измерений, до 26) и определяет принадлежность к той или иной «библиотеке».
Изображения 6,7,8 и 9 показывают результаты проведенного анализа. Как уже упоминалось ранее алгоритм учитывает морфологические, серо-шкальные и спектральные характеристики каждой частицы.
На рис. 5 находится увеличенное изображение одного из полученных графиков рассеяния в первом канале (хлорофилл) в зависимости от диаметра. Как видно из данного примера, основываясь на показателях размера и сигнатуры хлорофилла в данном случае можно выделить 4 различных типа организмов. Схожие результаты могут быть получены и при использовании стандартного проточного цитометра, т.к. образцом являются зеленые водоросли. Однако при ближайшем рассмотрении графиков рассеяния (Рис. 10), мы увидим, что рассматриваемая область содержит три разных таксона (имеющих одинаковый размер), а именно Staurastrum, Scenedesmus и Pediastrum (Рис. 11).
Таким образом использование морфологических характеристик при анализе получаемых данных помогает изолировать 3 различных вида зеленых водорослей, что не под силу стандартному проточному цитометру.
Заключение
Объединяя в себе морфологические измерения, измерения по серой шкале, свойственные для проточной цитометрии спектральные измерения и мощное программное обеспечение для статистического распознавания, прибор способен идентифицировать виды водорослей, являющиеся неразличимыми для других приборов. В дополнение ни одна другая система не позволяет вмещать большие образцы (до 2000 нм).
Больше информации на сайтах официального представителя Fluidimaging в России fluidimaging.ru