VisualAI для FlowCam – FlowCam Проточный цитометр с визуализацией

Продукты > Программное обеспечение > VisualAI

Надежные методы ИИ для белковых биотерапевтических препаратов VisualAITM — ПО FlowCam для независимого от образца анализа изображений.

Невидимые невооруженным глазом частицы в терапевтических белковых препаратах и других биотерапевтических средствах, вызывают серьёзную озабоченность у фармацевтических компаний в обеспечении качества их продукции.

Эти опасения возникают не только из-за нормативных требований, например, Фармакопея США (USP) <787>, в которых основное внимание уделяется подсчету невидимых частиц, но и из-за потенциальных изменений в стабильности, качестве и безопасности продукта, связанных с содержанием невидимых частиц. Методы анализа частиц, такие как потоковая визуализационная микроскопия (FIM), используются для мониторинга этих частиц на многих этапах разработки биотерапевтических препаратов, а также во время регулярного производства. Хотя различные технологии часто измеряют различные характеристики популяций частиц (например, концентрацию, размер, структуру), все они в итоге используются для оценки изменений в составе, которые могут заранее указывать на ухудшение качества и безопасность продукта.

Одну из важнейших характеристик образца, которую необходимо контролировать, — это тип частиц, присутствующих в белковом препарате, и их относительные концентрации. Эти препараты могут содержать частицы из различных источников, начиная от агрегаций белка6 до частиц из системы укупорки контейнера, используемой для хранения препарата (например, капель силиконового масла, стеклянных хлопьев) и примесей, вносимых в процессе производства (например, металлической стружки). FlowCam, прибор на основе технологии FIM, становится все более популярным для такого типа мониторинга. FlowCam, с помощью световой микроскопии, фиксирует изображения частиц, присутствующих в образце, с целью последующего анализа и определения концентрации частиц, а также их морфологии. Поскольку различные типы частиц на этих изображениях часто демонстрируют визуально различную морфологию, изображения FlowCam можно использовать для идентификации различных типов частиц в образце (изображения FlowCam распространенных типов биотерапевтических частиц можно увидеть на рис. 1). Кроме того, многие общие образцы частиц, определяемые этими методами, например, пузырьки воздуха и калибровочные шарики, могут быть использованы для удаления лишних изображений из анализа и получения более точных измерений концентрации частиц.

Рис. 1. Полученные с помощью FlowCam изображения частиц, часто встречающихся в белковых препаратах.

Наиболее распространенным вариантом использования этой информации о морфологии является идентификация белковых агрегаций и капель силиконового масла в препарате. Белковые агрегации и белки стрессов повсеместно встречаются в белковых препаратах из-за ограниченной стабильности белков в водной среде и влияния различных условий при регулярном производстве и обращении. Капли силиконового масла обычно образуются из-за шприцев, смазанных силиконовым маслом, которые часто используются для введения этих препаратов пациентам.

Хотя в некоторых исследованиях показано, что капли силиконового масла вредны, обычно считается, что они более безопасны для пациентов, чем белковые агрегаты. Поэтому полезно иметь возможность различать эти типы частиц при принятии решений о качестве продукта в отношении образца, содержащего оба типа частиц. Такая дифференциация частиц также является естественным применением для FlowCam из-за визуального различия между этими типами частиц: при изображении капли силиконового масла часто кажутся круглыми, в то время как белковые агрегаты кажутся более нерегулярными и аморфными, как видно на рисунке 1.

Четкие морфологические различия между белковыми агрегатами и каплями силиконового масла в сочетании с повсеместным распространением и практической важностью этих частиц побудили исследователей разработать автоматизированные алгоритмы для идентификации изображений белковых агрегатов и силиконового масла в базе данных FIM. Многие ранние методики, предложенные для этого анализа, в основном базировались на измерениях частиц по изображениям FIM, полученным прибором14,15. В этих методах, для идентификации изображений круглых капель силиконового масла, использовались измерения, связанные с размером частиц, интенсивностью цвета и округлостью (то есть соотношение сторон и отклонение от круглости на FlowCam). Подобные методы также используются встроенными утилитами классификации в VisualSpreadsheet® — программном обеспечении для FlowCam.

Хотя эти методы могут быть эффективными, подходы используют только небольшую часть информации о морфологии частиц в изображении — информации, которая может дополнительно использоваться для дифференциации этих двух типов частиц. Эти методы также могут быть чувствительны к настройкам программного обеспечения, используемого для обнаружения частиц в образце, поскольку они могут влиять на значения характеристик частиц, используемых при классификации.

В последнее время методы, основанные на искусственном интеллекте (ИИ), показали многообещающие результаты для такого анализа9. Для различения типов частиц эти методы используют не измеренные свойства частиц, а необработанные изображения, которые содержат больше информации. Кроме того, использование необработанных изображений напрямую, приводит к классификации частиц, которая более независима от настроек прибора. Однако методы на основе ИИ сложнее реализовать для большинства пользователей. Для этих методов обычно требуется, чтобы пользователи собирали тысячи изображений каждого типа частиц, полученных на их приборе FIM, которые затем используются для обучения ИИ. Этот процесс отнимает много времени у аналитика, а для управления сбором данных и проведения обучения ИИ часто требуется помощь специалистов экспертов, разбирающихся в ИИ. Кроме того, эти инструменты, как правило, разрабатывались для анализа изображений небольшого набора лекарственных препаратов на одном приборе FIM, в результате чего инструменты могут быть не столь эффективными для нескольких приборов и/или других лекарственных препаратов.

VisualAITM — это дополнительный программный пакет, который интегрируется в ПО «VisualSpreadsheet» и предназначен для упрощения идентификации с помощью ИИ белковых агрегатов и капель силиконового масла. VisualAI — это предварительно обученная утилита ИИ для идентификации изображений белковых агрегатов и капель силиконового масла диаметром более 3 мкм в оттенках серого, полученных с помощью FlowCam 8100 и FlowCam LO. Это программное обеспечение дает пользователям гораздо более точную дифференциацию белковых агрегатов и силиконового масла, чем это возможно с помощью утилит классификации на основе свойств частиц. В отличие от других методов анализа невидимых невооруженным глазом частиц на основе ИИ,

VisualAI предназначен для использования как «готовое решение»; пользователю не нужно предоставлять какие-либо обучающие изображения белковых агрегатов или силиконового масла, чтобы получить точную классификацию в своей системе и образцах. В качестве дополнительной функции VisualAI предлагает простые инструменты обнаружения аномалий для идентификации изображений некоторых распространенных типов частиц, которые не являются ни белковыми агрегатами, ни каплями силиконового масла. Эту функцию можно использовать для идентификации изображений таких частиц, как полистирольные калибровочные шарики и пузырьки воздуха, — изображений, которые часто появляются и могут искусственно завышать измеренную концентрацию частиц. В совокупности эти функции делают VisualAI мощным и надежным инструментом, но при этом исключительно простым в использовании при анализе данных от FlowCam для терапевтических белковых препаратов.

В этом информационном буклете демонстрируется эффективность классификации VisualAI на образцах, о которых известно, что они содержат агрегаты различных белков, капли силиконового масла или калибровочные шарики. Изображения в этом исследовании были получены на трех разных приборах FlowCam 8100, ни одно из которых не использовалось при разработке программного обеспечения. Поскольку VisualAI не зависит от образца, это тестирование также проводилось с использованием агрегатов нескольких разных белков. Мы также показываем эффективность программного обеспечения при анализе образцов, содержащих известную долю белковых агрегатов и капель силиконового масла, на четвертом приборе FlowCam 8100, чтобы продемонстрировать точность измерений состава белковых агрегатов и силиконового масла с помощью VisualAI.

Рис. 2. Графический пользовательский интерфейс VisualAI. (Слева) Образец коллажа изображений FIM из образца, содержащего 50% белковых агрегатов и 50% капель силиконового масла. Этот образец был приготовлен, как описано в этом исследовании. (Справа) Коллажи в графическом пользовательском интерфейсе VisualAI, показывающие изображения, идентифицированные утилитами ИИ, которые содержат белковые агрегаты (вверху), капли силиконового масла (в центре) и другие частицы (внизу).

Методы

Подготовка образца: Эффективность VisualAI оценивалась на образцах, содержащих только белковые агрегаты и капли силиконового масла, взвешенные в фосфатно-солевом буфере (PBS), которые не использовались при разработке VisualAI. Были приготовлены агрегаты четырех различных белков: бычий сывороточный альбумин (BSA), яичный альбумин, внутривенный иммуноглобулин (IVIg) и NIST моноклональное антитело (mAb). Препараты 1 мг/мл BSA и альбумина готовили путем смешивания 12 мг лиофилизованного белкового порошка с 12 мл PBS и легкого встряхивания полученного раствора на лабораторном встряхивателе в течение 30 минут. Препараты остальных белков готовили путем разбавления исходного белкового препарата в PBS с получением 12 мл препарата. Затем аликвоты этих белковых препаратов (5 мл) в конических пробирках объемом 15 мл подвергали воздействию одного из двух способов ускорения стресса стабильности для индуцирования агрегации: замораживание-оттаивание или встряхивание. Замораживание-оттаивание проводили, подвергая образцы четырем циклам замораживания-оттаивания, каждый из которых состоял из 30-минутного замораживания при -20 °C с последующим 10-минутным оттаиванием при 25 °C. Встряхивания выполняли, прикрепляя образцы к лабораторному встряхивателю и встряхивая образцы при максимальной скорости и угле наклона платформы в течение четырех часов. Эмульсии силиконового масла готовили путем создания 10% (v:v) раствора силиконового масла в PBS и смешивания полученного состава в лабораторном блендере на максимальной скорости в течение 20 секунд. Затем полученную эмульсию разбавляли PBS в соотношении 1:1000 для получения подходящей концентрации капель для анализа FlowCam.

Анализ с помощью FlowCam: для анализа образцов, содержащих каждый из четырех типов белков, использовались четыре различных прибора FlowCam 8100. Свежеприготовленные образцы силиконового масла также анализировали параллельно с каждым образцом белка. Каждый прибор FlowCam был оснащен объективом 10X и проточной ячейкой FOV80. Перед анализом жидкостная система прибора была промыта 10% раствором Hellmanex III, затем водой, а затем PBS. Приборы работали с рекомендуемыми настройками для образцов белков и VisualAI; 15 пороговых значений темных и светлых пикселей с 3 итерациями закрытия отверстий, расстоянием 4 мкм до ближайших соседей и отключенной скользящей калибровкой. Интенсивность фона была установлена примерно на 170. Для получения наилучшего качества изображения для каждого устройства FlowCam было произведена автофокусировка с использованием калибровочных шариков из полистиролового латекса размером 15 мкм. После автофокусировки на калибровочных шариках, был выполнен запуск режима автоизображения, чтобы подтвердить, что прибор находится в фокусе. Чтобы проверить надежность алгоритма, образцы NIST mAb были проанализированы на приборе, который не был сфокусирован перед измерениями — потенциальная ошибка, с которой можно столкнуться при сборе данных для анализа морфологии частиц. Затем устройства промывали, как описано выше, и использовали для анализа “пустой” пробы PBS, которая содержала незначительные концентрации частиц, для оценки фонового содержания частиц в жидкости. Этот процесс очистки и анализа пустой пробы повторяли до тех пор, пока в пробе PBS не было обнаружено менее 1000 частиц/мл.

Три аликвоты по 1 мл на образец были проанализированы на каждом из четырех устройств FlowCam 8100. Большинство образцов белка анализировали при скорости потока 0,15 мл/мин и скорости автоизображения 22 кадра в секунду. Образцы альбумина и соответствующие изображения силиконового масла анализировали при стандартной настройке скорости FlowCam LO (0,2 мл/мин) с использованием скорости срабатывания затвора 30 кадров в секунду, чтобы компенсировать более высокий расход. Жидкостную систему приборов промывали между измерениями с использованием метода, описанного ранее. Как описано ранее, дополнительную очистку и холостой анализ PBS проводили между образцами чистого белкового агрегата и силиконового масла, чтобы обеспечить минимальное пересечение между разными образцами. Все наборы данных FlowCam были подвергнуты постобработке для фильтрации изображений частиц имеющих диаметр (ESD) менее 3 мкм, а также для удаления таких очевидных артефактов, как пузырьки воздуха, чтобы гарантировать, что все изображения состоят преимущественно из представляющего интерес типа частиц.

Точность классификатора VisualAI: Образцы агрегатов IVIg, альбумина и NIST mAb вместе с их парными образцами силиконового масла были проанализированы с помощью VisualAI для оценки эффективности классификации образцов, которые, как известно, содержат только белковые агрегаты, микрокапли силиконового масла или калибровочные шарики. Этот анализ также был выполнен для частиц со значениями диаметра (ESD) в различных диапазонах размеров: 3–5 мкм и >5 мкм. Изображения белковых агрегатов и капель силиконового масла размером 2–3 мкм были исключены из этого анализа. В то время как в этом диапазоне размеров VisualAI часто достигает точности классификации в пределах 80–90%, точность программного обеспечения в этом диапазоне сильнее зависит от прибора и образца в этом диапазоне, чем для более крупных частиц. Рекомендуется ограничиться анализом VisualAI частицам размером более 3 мкм.

В качестве дополнительного сравнения, эффективность VisualAI была сопоставлена с упрощенными версиями упомянутых методов идентификации силиконового масла без использования ИИ: классификация на основе S-фактора14 и классификаторы на основе случайного леса (ансамбля решающих деревьев)15. В обоих методах, чтобы определить, содержит ли изображение агрегат белка или каплю силиконового масла, анализируются свойства частиц, а не необработанные изображения FlowCam. Оба метода также обучают отдельные классификаторы для частиц разного диаметра (ESD) для учета изменений в видимой морфологии частиц по мере увеличения размера. Для сравнительного анализа частицы были разделены только на две категории размеров: 3–5 мкм и >5 мкм. Оба метода были обучены с использованием одних и тех же данных FlowCam, используемых для разработки VisualAI, со взвешиванием функций потерь для обоих методов на основе относительного количества обучающих данных для каждого класса в каждой категории размера. Затем обученные методы были применены к данным FlowCam, собранным в рамках этого исследования, чтобы оценить общую точность каждого метода по сравнению с VisualAI.

Классификация на основе S-фактора была выполнена путем вычисления модифицированного S-фактора для каждой частицы и использования этого значения для предсказания идентичности частицы. Модифицированные значения S-фактора были вычислены с использованием соотношения сторон каждой частицы, отклонения от круглости и сигма-интенсивности. Вместо использования оптимизированных вручную пороговых значений S-фактора для выполнения окончательной классификации, классификация частиц была выполнена путем обучения классификаторов логистической регрессии значениям S-фактора для обучающих данных в каждой категории размера и использования соответствующего размеру обученного классификатора для анализа последующих изображений на основе их S-фактора.

Классификаторы на основе случайного леса были обучены классифицировать изображения опираясь на их диаметр (ESD), соотношение сторон, отклонение от круглости, (среднюю) интенсивность, сигма-интенсивность и градиент края — свойств, которые, за исключением краевого градиента, были идентифицированы как полезные для различения белковых агрегатов и капель силиконового масла в первоначальном исследовании15. Значения каждой характеристики частицы были приведены к среднему значению и стандартному отклонению этой характеристики по всей обучающей выборке во время обучения и тестирования, чтобы учесть различные числовые диапазоны, которые может принимать каждая характеристика частицы. Случайные леса, состоящие из 128 деревьев, были обучены на частицах в каждом диапазоне размеров. Обученные классификаторы применялись к данным, собранным в ходе этого исследования, таким же образом, как и классификаторы S-фактора.

Точность оценки состава с помощью VisualAI: Основной вариант использования VisualAI — определение относительного состава белковых агрегатов и микрокапель силиконового масла в образце. Чтобы продемонстрировать эффективность этого программного обеспечения, образцы, содержащие известное соотношение белковых агрегатов и капель силиконового масла, были визуализированы и проанализированы с помощью программного обеспечения для оценки состава каждого образца. Образцы, содержащие чистые агрегаты BSA, образующиеся при встряхивании, и микрокапли силиконового масла, были подготовлены и проанализированы, как описано выше, для определения концентрации частиц в каждом образце. Частицы с эквивалентным сферическим диаметром от 2 до 3 мкм (меньше нижнего предела размера для VisualAI) не были исключены из этой оценки концентрации. После измерения эти образцы смешивали и разбавляли PBS для приготовления смесей, содержащих примерно 100 000 частиц/мл либо 25%, 50% или 75% белковых агрегатов, а остальное — капли силиконового масла. Для каждого состава смеси было приготовлено по три образца. Каждый из этих смешанных образцов был подготовлен и немедленно проанализирован на FlowCam, как описано выше, чтобы свести к минимуму любую агрегацию белка, вызванную силиконовым маслом. Изображения всех частиц размером более 3 мкм из каждой смеси, а также чистых образцов были проанализированы для оценки соответствия между прогнозируемым и фактическим составом частиц в каждом образце.

Результаты и Обсуждение

Анализ с помощью FlowCam: Образцы, содержащие только белковые агрегаты или капли силиконового масла, анализировались с помощью четырех различных приборов FlowCam 8100. На рис. 3 показаны изображения образцов белковых агрегатов и капель силиконового масла из трех протестированных приборов FlowCam. Как и ожидалось, белковые агрегаты и капли силиконового масла, отображенные на одном FlowCam, обычно имеют различную морфологию частиц; капли силиконового масла обычно имеют круглую форму с четкой концентрической кольцевой структурой, в то время как белковые агрегаты аморфны и имеют неправильную форму. Хотя белково-силовые агрегаты имеют некоторые общие черты с каплями силиконового масла, они часто легко распознаются благодаря различиям в морфологии. Некоторые изображения белковых агрегатов и капель силиконового масла показали круглые структуры, напоминающие изображения силиконового масла. Нечеткие капли силиконового масла часто имеют асимметричную или иным образом запутанную концентрическую кольцевую структуру, которую трудно отличить от белковых агрегатов.

Рис. 3. Примеры изображений белковых агрегатов и капель силиконового масла, полученных на трех разных устройствах FlowCam 8100. Каждая строка соответствует данным по одному устройству. Соответствующие сведения о работе FlowCam включены в заголовок каждой строки. Изображения белковых агрегатов были получены из белка, обозначенного под каждым коллажем, и состоят из смеси агрегатов, образованных замораживанием- оттаиванием и встряхиванием.

Эти отличительные морфологические признаки также могут изменяться в зависимости от положения фокусировки устройства: изображения частиц с расфокусированного FlowCam (рис. 3, нижний ряд) в среднем намного темнее и часто пропускают такие отличительные признаки, как яркое пятно в середине многих капель силиконового масла. Эти и другие проблемы могут усложнить теоретически простую задачу классификации частиц, особенно по мере уменьшения диаметра частиц, а два типа частиц по своей сути кажутся более похожими.

Точность классификации с помощью VisualAI: Изображения FlowCam, полученные из образцов, содержащих только белковые агрегаты и капли силиконового масла, были проанализированы с помощью VisualAI для оценки точности классификации программного обеспечения. На рис. 4 показаны матрицы неточностей, указывающие точность классификации программного обеспечения для частиц, подобных тем, что показаны на рис. 3. Эти таблицы демонстрируют, что VisualAI обеспечивает точность классификации, близкую, если не превышающую 90%, для образцов, приборов и большинства диапазонов размеров. Важно отметить, что программное обеспечение достигает такой эффективности как при “рекомендованном” расходе 0,15 мл/мин, так и при более высоком расходе 0,2 мл/мин, который требуется для работы FlowCam LO. Точность классификации улучшается с увеличением размера частиц, достигая примерно 95% точности классификации для частиц размером более 5 мкм, но снижаясь на 1–3% для частиц размером 3- 5 мкм для большинства устройств. Такое поведение ожидаемо, поскольку изображения небольших белковых агрегатов напоминают изображения маленьких капель силиконового масла. Поскольку эти мелкие частицы трудно классифицировать даже человеку-оператору FlowCam, неудивительно, что в типичных наборах данных FlowCam эффективность VisualAI снижается для изображений меньшего размера.

Неожиданным результатом этого анализа стала точная классификация VisualAI изображений агрегатов белка и капель силиконового масла, снятых на устройстве FlowCam, которое не было должным образом сфокусировано перед съемкой изображения. Это демонстрирует надежность VisualAI, поскольку данные, собранные на не настроенном оптимально приборе, по-прежнему могут быть эффективно проанализированы в пределах диапазона размеров программного обеспечения. Хотя перед сбором данных для анализа с помощью VisualAI по-прежнему настоятельно рекомендуется автофокусировка прибора, данные, собранные без оптимальной фокусировки, по-прежнему могут быть эффективно проанализированы с помощью VisualAI.

Рис. 4. Матрицы неточностей, показывающие эффективность классификации VisualAI, а также методов на основе S-фактора и алгоритма случайного леса на белковых агрегатах и каплях силиконового масла разного размера, собранных на трех отдельных устройствах FlowCam. Матрицы неточностей для каждого классификатора и размера частиц размещены рядом в каждой таблице для простоты сравнения и заданы заголовками строк и столбцов. Синие, красные и зеленые матрицы соответствуют матрицам неточностей для методов VisualAI, S-фактора и случайного леса, соответственно. Белок, используемый для создания агрегатов, а также любые уникальные особенности данных (более высокий расход или несфокусированные изображения) показаны слева от каждой матрицы.

Подобные матрицы неточностей показывают долю изображений каждого типа частиц (строки матрицы), которые были классифицированы как три возможных метки, которые может возвращать каждый классификатор (столбцы матрицы). Точность классификаторов для каждого образца и диапазона размеров представляет собой долю частиц в этом образце, которой была присвоена правильная метка (например, изображения белковых агрегатов классифицируются как белковые агрегаты). Окраска каждой ячейки отражает долю изображений частиц каждого типа, которым была присвоена соответствующая метка, более темный цвет указывает на более высокие доли с правильной меткой.

На рис. 4 также показана эффективность методов идентификации силиконового масла на основе S-фактора и случайного леса при обучении на тех же данных, которые использовались для разработки VisualAI. Точность этих других подходов в среднем была значительно хуже, чем точность, полученная с помощью VisualAI. Эти методы также не обеспечивают такой стабильной эффективности для приборов FlowCam, как VisualAI, что иногда приводит к резким изменениям не только в общей точности, но и в относительной частоте предсказаний белковых агрегатов по сравнению с предсказаниями капель силиконового масла — т.е. они могут завышать содержание силиконового масла в данных с одним FlowCam, но недооценивать содержание в другом устройстве. Следует отметить, что, в отличие от первоначальных исследований, эти методы были разработаны и применены к данным FIM, полученным на нескольких приборах, а не на одном приборе. Хотя адаптация этих подходов к отдельным приборам FlowCam, вероятно, даст лучшую эффективность классификации, VisualAI способен достичь высокой точности без какой-либо настройки конкретного прибора.

Высокая точность классификации VisualAI для различных приборов FlowCam и типов образцов делает его мощным и широко применимым инструментом для различения белковых агрегатов и капель силиконового масла. VisualAI также легко интегрируется в типичный биотерапевтический анализ с помощью FlowCam, поскольку программное обеспечение не требует затрат времени, труда и объема образца, необходимых для разработки других методов для этого анализа, включая другие методы на основе ИИ. Независимый характер VisualAI в сочетании с его надежностью позволяет программному обеспечению хорошо работать с несколькими конфигурациями приборов и образцов. Эта функция позволяет пользователям FlowCam, работающим с различными биотерапевтическими препаратами или с несколькими приборами FlowCam, использовать единый стандартный программный инструмент для мониторинга силиконового масла в полученном массиве данных и преимущества сопоставимости, связанные с единой стратегией мониторинга.

Кроме того, на этих устройствах VisualAI добился >92% распознавания калибровочных шариков как “других” частиц. Превосходное распознавание шариков может помочь операторам автоматически обнаруживать и помечать изображения этих частиц, когда они появляются в наборах данных, повышая точность не только сообщаемых концентраций белковых агрегатов и капель силиконового масла, но и общей концентрации частиц в образце. Подобных результатов можно ожидать и с пузырьками воздуха, поскольку для неопытного глаза изображения пузырьков воздуха могут напоминать калибровочные шарики.

Точность состава при использовании VisualAI: Образцы, содержащие известные смеси белковых агрегатов и капель силиконового масла, были проанализированы с помощью VisualAI, чтобы оценить, насколько точно программное обеспечение может предсказать состав образца. На рис. 5 показана предсказанная VisualAI доля белковых агрегатов в каждой смеси, а также исходное количество чистых белковых агрегатов и силиконового масла с использованием частиц размером более 3 мкм в каждом образце. Хотя между фактическим и прогнозируемым составом есть небольшое расхождение, прогнозируемое содержание белковых агрегатов в каждом образце сильно коррелирует с фактическим содержанием частиц в каждом образце.

Эта корреляция предполагает, что ПО VisualAI чувствительно к общему составу белок-силиконовое масло в смешанных образцах и в сочетании с FlowCam может использоваться для оценки доли белковых частиц в образце. Небольшое расхождение между заявленным и фактическим составом белковых агрегатов можно частично объяснить ошибками классификации, допущенными VisualAI. Поскольку в образцах чистого белкового агрегата и капель силиконового масла присутствует небольшая доля ошибочно идентифицированных частиц, ожидаемые составы для этих смесей немного ближе к 50%, чем если бы модель была совершенно точной — тренд, наблюдаемый в составах, представленных на рис. 5.

Важно отметить, что содержание частиц размером более 2 мкм соответствовало желаемому составу, включая частицы диаметром 2- 3 мкм, которые не были проанализированы с помощью VisualAI для определения состава. Как и в случае большинства биотерапевтических образцов, большая часть содержания частиц, обнаруженных с помощью FlowCam 8100 с объективом 10X, находится в пределах этого исключенного диапазона размеров. Несмотря на игнорирование большей части изображений в этих искусственных смесях белковых агрегатов и силиконового масла, VisualAI все же смог точно предсказать состав белковых агрегатов и капель силиконового масла в этих образцах.

Другие соображения: Одна из проблем, присущих стратегиям обнаружения белковых агрегатов и капель силиконового масла, таким как VisualAI, заключается в возможности наблюдения белковых агрегатов, прикрепленных к каплям силиконового масла и одновременно являющихся обоими типами частиц. Эти гибридные частицы являются обычным явлением, когда белок подвергается воздействию силиконового масла в течение длительного периода, поскольку на границе раздела буфер-масло может происходить адсорбция и агрегация белков8. Этот эффект контролировался в этом исследовании путем приготовления смесей непосредственно перед выполнением анализа FlowCam, что сводило к минимуму время, необходимое для адсорбции и агрегации белка, которые могли произойти. В реальных образцах эти гибридные типы частиц могут появляться чаще.

Рис. 5. Состав белковых агрегатов, предсказанный VisualAI, в образцах, содержащих известные доли частиц белковых агрегатов. Точки представляют собой средние значения, полученные из трех образцов. Линия тренда, уравнение и значение R2 были получены с использованием линейной регрессии по фактическим и прогнозируемым данным о составе белковых агрегатов.

Как и другие стратегии обнаружения силиконового масла, VisualAI в настоящее время не обнаруживает эти гибридные частицы и всегда будет назначать только один класс (например, белковый агрегат или капля силиконового масла) каждому изображению частицы. Хотя небольшое количество этих гибридов вряд ли существенно повлияет на общий состав, оцениваемый VisualAI, чтобы получить точную оценку состава пользователям может потребоваться постобработка классифицированных изображений, чтобы идентифицировать и, возможно, переклассифицировать эти гибридные частицы, если они появляются в значительных количествах в образце.

Для учета изображений этих гибридных частиц и других типов небелковых агрегатов, капель не силиконового масла VisualAI предоставляет пользователю гибкость в определении новых классов (т.е. дополнительных типов частиц), которым изображения могут быть переназначены вручную после первоначальной классификации. Эти функции позволяют пользователям отслеживать концентрации других типов частиц, которые в настоящее время явно не отслеживаются VisualAI. Эти инструменты также можно использовать для ручного переназначения изображений частиц между белковым агрегатом, силиконовым маслом и другими классами, что позволяет пользователю дополнительно повысить точность определения концентраций частиц, сообщаемых программным обеспечением.

Выводы

Visual AI в сочетании с FlowCam 8100 и/или FlowCam LO представляет собой надежное и мощное интегрированное решение потоковой визуализации для идентификации составов белковых агрегатов и капель силиконового масла в биотерапевтических образцах. VisualAI обеспечивает точность >90% как при идентификации этих типов частиц на отдельных изображениях, так и при прогнозировании общего состава этих частиц в образце. Готовое к немедленному использованию программное обеспечение позволяет легко интегрировать подход к мониторингу белковых агрегатов и силиконового масла в существующие рабочие процессы биотерапевтического анализа на основе FlowCam, в том числе с использованием нескольких лекарственных препаратов и приборов FlowCam. VisualAI позволяет исследователям легко получать автоматическую классификацию частиц в биотерапевтических препаратах из данных FlowCam, что позволяет им принимать более эффективные решения о качестве своих лекарственных препаратов и улучшать общее качество лечения, которое в конечном итоге получают пациенты.

VisualAI — это дополнительный модуль, доступный в VisualSpreadsheet 6